共聚焦顯微鏡是生物學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域中觀察細(xì)胞尺度的結(jié)構(gòu)的重要儀器。通過(guò)與樣品面共軛的針孔對(duì)離焦雜散光的限制，共聚焦顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)接近由衍射成像系統(tǒng)孔徑導(dǎo)致的阿貝衍射極限分辨率的成像。

　　共聚焦顯微成像是一般生物細(xì)胞學(xué)研究的常用工具，一般共聚焦成像系統(tǒng)的分辨率在半波長(zhǎng)左右。然而目前的共聚焦顯微鏡在分辨率上仍不足以支持對(duì)細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等更小尺度的樣品的觀察。因此，研究人員在共聚焦顯微系統(tǒng)的分辨率提升問(wèn)題上投入了大量的研究，基于共聚焦顯微系統(tǒng)的超分辨顯微方法也應(yīng)運(yùn)而生。

　　熒光輻射差分超分辨顯微方法(FED)是一種利用正負(fù)共聚焦顯微圖像的差分后期處理來(lái)提升成像分辨率以及降低背景噪聲的方法，由浙江大學(xué)劉旭教授、匡翠方教授團(tuán)隊(duì)于2013年提出。其本質(zhì)是可以在相同波長(zhǎng)的激發(fā)光下利用空心焦斑的暗斑區(qū)域來(lái)提取實(shí)心焦斑里的高頻信息，在不需要特殊熒光標(biāo)記的樣品上也可以實(shí)現(xiàn)超分辨顯微成像，具有普適性好、背景噪聲低等特點(diǎn)。但是該方法需要獲取兩幅共聚焦圖像來(lái)得到一張超分辨顯微圖像，這大大降低成像速度，不利于在快速運(yùn)動(dòng)的活細(xì)胞中進(jìn)行成像研究。

　　創(chuàng)新研究

　　為了能夠更進(jìn)一步提升FED的成像速度，浙江大學(xué)劉旭教授、匡翠方教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出了一種共路相位調(diào)制的并行焦斑掃描方法，將FED的成像速度提升為原來(lái)的兩倍，更加適合活細(xì)胞顯微成像。

　　共路調(diào)制并行掃描方法利用偏振相關(guān)空間光調(diào)制器(SLM)分別對(duì)激發(fā)光中的S偏振光和P偏振光分別進(jìn)行相位調(diào)制，其中渦旋相位調(diào)制負(fù)責(zé)形成空心暗斑，而閃耀光柵調(diào)制負(fù)責(zé)把激發(fā)光中實(shí)心亮斑和空心暗斑錯(cuò)開一定距離，以此實(shí)現(xiàn)樣品面上雙焦斑聚焦結(jié)果，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)雙焦斑并行掃描以提升FED的成像速度(圖1)。

　　圖1 共路并行熒光輻射差分超分辨顯微系統(tǒng)

　　由于該方法是在樣品表面將實(shí)心焦斑和空心焦斑錯(cuò)開一定距離而實(shí)現(xiàn)并行掃描并行采集，因此采集的圖像會(huì)有一定的錯(cuò)位，需要對(duì)該錯(cuò)位距離進(jìn)行標(biāo)定，然后通過(guò)平移與裁切實(shí)現(xiàn)圖像對(duì)齊，再通過(guò)FED方法實(shí)現(xiàn)分辨率的提升，如圖2所示。

　　圖2 共路并行FED處理過(guò)程

　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證該系統(tǒng)的分辨率，團(tuán)隊(duì)利用100 nm熒光顆粒進(jìn)行分辨率標(biāo)定測(cè)試。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)的分辨率能夠達(dá)到133 nm，并且圖像的背景噪聲得到了進(jìn)一步的降低。

　　圖3 100 nm熒光顆粒分辨率測(cè)試

　　同時(shí)，為了檢驗(yàn)該系統(tǒng)在生物細(xì)胞中的應(yīng)用效果，團(tuán)隊(duì)采集了細(xì)胞波形蛋白的成像結(jié)果(圖4)。通過(guò)對(duì)比a1與b1、a2與b2.可以看出在較為復(fù)雜的生物細(xì)胞中，共路并行FED方法能夠在實(shí)現(xiàn)背景噪聲降低的同時(shí)提升信噪比與分辨率，具有較為優(yōu)秀的顯微成像性能。

　　圖4 細(xì)胞波形蛋白成像結(jié)果

　　總結(jié)與展望

　　通過(guò)SLM來(lái)實(shí)現(xiàn)共路并行焦斑掃描的方式既可以優(yōu)化光斑質(zhì)量保證成像效果，也可以進(jìn)一步提升FED的成像速度，是一種較為實(shí)用的成像方法。

　　接下來(lái)，團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步利用全息相位調(diào)制的方法實(shí)現(xiàn)四焦斑或者六焦斑掃描以實(shí)現(xiàn)更高的成像速度提升。

　　參考文獻(xiàn)： 中國(guó)光學(xué)期刊網(wǎng)

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